酵母型真菌基因编辑
酵母型真菌在基础研究与工业应用中占据不可替代的地位——从作为模式生物的酿酒酵母，到工业蛋白表达的毕赤酵母，再到临床重要的念珠菌与隐球菌，每一类酵母都有其独特的遗传背景与转化难点。锐志魔方已在酵母型真菌中建立成熟的 CRISPR-Cas9 与同源重组双路线编辑体系，累计完成 10 余个属、20 余个种的遗传改造项目，可为工业酶、香料、精细化学品与药物靶点研究提供从方案设计到稳转株交付的全流程服务。
一、已成功完成基因编辑的酵母种类
- 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae：最经典的模式真核底盘，已完成敲除、过表达、点突变到多基因组合改造，涵盖 BY4741、BY4742、YJM195 等常用菌株背景，实验周期短、效率高（约 40+ 订单，2020–2026）。
- 毕赤酵母 Komagataella phaffii / Pichia pastoris：工业蛋白表达主力宿主，已完成敲除、过表达、GS115 / SMD1163 改造与多基因组合表达（约 20+ 订单，2022–2026）。
- 白色念珠菌 Candida albicans：重要机会性致病真菌，已完成 CRISPR 敲除、RNAi 沉默、过表达及 dCas9 介导的 CRISPRi 抑制等多路径项目（约 50+ 订单，酵母项目中数量最多，2022–2026）。
- 热带念珠菌 Candida tropicalis：临床仅次于白念珠菌的重要念珠菌，已建立专属转化优化体系，完成 CRISPRi 与同源重组敲除（约 15+ 订单，2025–2026）。
- 新生隐球菌 Cryptococcus neoformans：担子菌酵母，细胞壁与启动子偏好与子囊菌酵母差异大，已用原生质体 PEG、电穿孔与 CRISPR-Cas9 完成 H99 等多基因敲除（约 30+ 订单，2021–2026）。
- 解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica：高产脂肪酶与强分泌能力，已完成过表达与敲除株构建（约 12+ 订单，2021–2025）。
- 克鲁维酵母属 Kluyveromyces（马克斯克鲁维、乳酸克鲁维）：已完成 HSP26 敲除、定点过表达与 GG799 改造（约 12+ 订单，2025–2026）。
- 其他已交付酵母：产朊假丝酵母、耳念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌、扣囊酵母、鲁氏酵母、汉逊酵母、圆红冬孢酵母、浅白隐球酵母、Candida intermedia 等。
二、覆盖的技术路线
| 技术模块 | 成熟度 | 验证菌种 |
|---|---|---|
| CRISPR/Cas9 精准敲除 | ✅ 成熟 | 白色念珠菌、热带念珠菌、隐球菌、耶氏酵母 |
| CRISPRi 基因抑制（dCas9） | ✅ 成熟 | 白色念珠菌、热带念珠菌 |
| 同源重组敲除 | ✅ 成熟 | 酿酒酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、耶氏酵母 |
| 基因过表达 | ✅ 成熟 | 酿酒酵母、毕赤酵母、耶氏酵母、产朊假丝酵母 |
| RNAi 基因沉默 | ✅ 成熟 | 白色念珠菌 |
| 荧光标记菌株（GFP 等） | ✅ 成熟 | 隐球菌、白色念珠菌 |
| 定点整合 / 定点过表达 | ✅ 成熟 | 克鲁维酵母 |
| 转座子突变体库构建 | ✅ 成熟 | Candida intermedia |
三、转化方法体系
- 化学转化（醋酸锂 / PEG 法）：适用于酿酒酵母、克鲁维酵母，操作简便、效率高。
- 电穿孔转化：适用于隐球菌、毕赤酵母、白色念珠菌等。
- 原生质体 PEG 转化：适用于隐球菌、解脂耶氏酵母。
- 农杆菌介导转化（ATMT）：适用于部分酵母。
四、筛选标记系统
- 营养缺陷型标记：URA3、LEU2、TRP1、HIS3、ADE2——常用于酿酒酵母 / 克鲁维酵母。
- 抗生素抗性标记：潮霉素（hph）、G418（kanMX）、博来霉素（ble）、诺尔丝菌素（nat1）、草铵膦（bar）。
- 双向筛选标记：URA3 / pyrG（5-FOA 反筛）、amdS（乙酰胺 / 氟乙酰胺）。
- 多轮敲除标记回收：Cre/loxP、FRT/FLP 系统。
五、交付标准
- 敲除株经 PCR 鉴定 + 测序确认；过表达株经 RT-qPCR 验证表达水平（必要时 Western blot 验证蛋白）。
- 提供完整实验报告（含载体图谱、测序结果、菌株保存）。
- 至少交付 3 个独立转化子；甘油管 -80℃ 保存，可长期稳定传代。
从模式酵母到临床病原酵母，从基础遗传改造到工业菌株优化，我们提供全方位的酵母型真菌基因编辑解决方案。
| 酵母（中文 / 拉丁名） | 编辑手段 | 特点 | 潜在应用方向 |
|---|---|---|---|
| 克鲁维酵母 Kluyveromyces spp. | CRISPR-Cas9 / 同源重组；原生质体或电转化；ura3 等营养缺陷型标记；可整合外源表达盒。 | 兼性好氧/厌氧，可利用乳糖、半乳糖等非常规碳源；遗传背景较清晰，具 GRAS 安全认知。 | 乳制品酶（凝乳酶、β-半乳糖苷酶）、乳糖水解、食品与饲料用酶、细胞工厂。 |
| 鲁氏酵母 Zygosaccharomyces rouxii | CRISPR-Cas9 / 同源重组；耐高渗条件下原生质体转化，需适配高盐/高糖筛选体系。 | 极强耐高渗透压、耐高糖与高盐，是嗜盐/耐盐发酵代表，常用于高盐酿造。 | 高盐/高糖发酵食品（酱油、豆酱、腌制）、耐渗透压机制研究、风味物质合成。 |
| 毕赤酵母 Komagataella phaffii | CRISPR-Cas9 / 同源重组；AOX1 强启动子驱动分泌表达；Cre-loxP / 标记回收多轮编辑。 | 甲醇诱导 AOX1 强启动子，高细胞密度发酵，强分泌表达与真核翻译后修饰。 | 重组蛋白/工业酶（酶制剂、抗原、抗体片段）、药用蛋白、饲料酶。 |
| 解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica | CRISPR-Cas9 / 同源重组；多拷贝整合与启动子工程；标记回收实现多轮迭代；擅长脂代谢改造。 | 天然高效利用油脂、烷烃等疏水性碳源，胞内脂质体积累高，疏水蛋白表达强，遗传工具成熟。 | 油脂化学品（脂肪酸、脂质）、柠檬酸等有机酸、单细胞蛋白/微生物油脂、环境修复。 |
| 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae | CRISPR-Cas9 / 同源重组；成熟基因组合成与多位点编辑；Cre-loxP / 标记回收；通路模块化组装。 | 模式真核生物，遗传与组学工具最完备，繁殖快、转化效率高，最成熟的真核底盘。 | 燃料乙醇、平台化学品（有机酸、氨基酸）、疫苗与重组蛋白、合成生物学底盘。 |
| 汉逊酵母 Ogataea polymorpha | CRISPR-Cas9 / 同源重组；甲醇代谢强启动子（MOX/FMD）；耐热、可高细胞密度发酵。 | 嗜热/耐热，以甲醇为唯一碳源，高细胞密度培养，蛋白折叠质量高。 | 工业酶（耐高温酶）、药用蛋白、甲醇生物转化、单细胞蛋白。 |
| 马科斯克鲁维酵母 Kluyveromyces marxianus | CRISPR-Cas9 / 同源重组；耐高温发酵（可达 45 ℃），原生质体/电转化；ura3 等标记。 | 耐热（40–52 ℃ 可生长），可利用乳糖、菊粉等非常规碳源，生长快、底物谱广，GRAS 认知。 | 高温发酵（节能、降污染）、乳清/乳糖高值化、食品酶、生物乙醇与平台化学品。 |