真菌敲除株构建

真菌基因敲除是解析致病、代谢与发育机制的金标准。锐志魔方根据酵母型真菌、丝状真菌及大型食用真菌的差异，采用同源重组敲除或 CRISPR-Cas9 敲除策略，交付精准、可遗传稳定的敲除株。

一、真菌敲除策略

  • 同源重组敲除：适用于毕赤酵母、酿酒酵母等同源重组效率较高的酵母；通过构建含上、下游同源臂的线性 DNA 片段，直接替换目标基因；
  • CRISPR-Cas9 敲除：在丝状真菌中配合 AMA1 自主复制载体、ku70/ku80 缺失背景可大幅提高同源重组效率；适用于烟曲霉、白念珠菌、隐球菌、曲霉、青霉等；
  • 启动子替换 / 条件敲除：对必需基因采用可诱导启动子替换，实现条件性敲除或表达下调。

二、典型构建流程

真菌敲除株构建流程
图 1　单倍体新生隐球菌敲除株构建流程：打靶载体构建 → 转化 → 平板筛选 → 液体培养 → Sanger 测序验证。

三、可承接真菌类群

分类可承接真菌
酵母型真菌毕赤酵母、酿酒酵母、白念珠菌、隐球菌、阿萨希毛孢子菌、马尔尼菲蓝状菌
丝状真菌曲霉属、青霉属、镰刀菌、植物炭疽菌
大型真菌香菇、双孢蘑菇、金针菇等
其他具体可咨询定制

四、交付标准

  • 目标位点 PCR 验证与 Sanger 测序；
  • 至少 2 个独立阳性克隆；
  • 甘油菌、质粒图谱及实验报告。

五、参考文献

  • Matsumoto Y, Nagamachi T, Yoshikawa A, et al. A joint PCR-based gene-targeting method using electroporation in the pathogenic fungus Trichosporon asahii. AMB Express, 2022, 12(1): 1-11.
  • Jiang H, Shen Y, Liu W, et al. Deletion of the putative stretch-activated ion channel Mid1 is hypervirulent in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology, 2014, 62: 62-70.
  • 刘凯毅, 任剑星, 张晓晓, 等. TPK3 基因敲除对酿酒酵母耐受性的影响. 食品研究与开发, 2021, 42(18): 6.
  • 郭燕华, 安邦. 基于 CRISPR-Cas9 技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统. 微生物学通报, 2020, 47(1): 9.
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