支原体过表达株构建

支原体无细胞壁、基因组小、营养要求苛刻，是微生物遗传操作的难点底盘。锐志魔方以 Tn4001 转座子与 pMT85 质粒体系为基础，提供肺炎支原体、牛支原体等多种支原体的过表达株与转座子突变体文库构建服务。

一、支原体遗传操作的特殊性

  • 无细胞壁，无法使用常规革兰氏菌的电转化条件；
  • 基因组小、密码子偏好明显，外源启动子常需优化；
  • 生长缓慢、培养条件苛刻，转化后筛选周期长；
  • 可用于支原体的遗传工具非常有限，目前以 Tn916/Tn4001 转座子为主流。

二、Tn4001 过表达株构建平台

Tn4001 是 4.5 kb 的复合型转座子，携带庆大霉素 / 卡那霉素 / 妥布霉素抗性基因。以 pMT85 为出发载体，将目标表达盒嵌入 Tn4001 骨架，通过转座酶介导将表达盒随机整合至支原体基因组，获得稳定遗传的过表达株。

三、服务流程

  1. 客户提供目标基因序列与支原体菌株；
  2. 锐志魔方设计表达盒（启动子、RBS、终止子优化）；
  3. 构建 pMT85-Tn4001 供体质粒并转化支原体；
  4. 抗性筛选、单克隆纯化与基因型鉴定；
  5. qPCR / Western 验证表达水平并交付甘油菌。

四、技术优势

  • 丰富的支原体传代培养与厌氧/微需氧培养经验；
  • 已建立多种支原体转化与筛选体系；
  • 可根据菌株特点定向改良 pMT85 质粒与启动子元件。

五、参考文献

  • Zhu X, Baranowski E, Dong Y, et al. An emerging role for cyclic dinucleotide phosphodiesterase and nanoRNase activities in Mycoplasma bovis: Securing survival in cell culture. PLoS Pathogens, 2020, 16(6): e1008661.
  • Yamamoto T, Kida Y, Sakamoto Y, et al. Mpn491, a secreted nuclease of Mycoplasma pneumoniae, plays a critical role in evading killing by neutrophil extracellular traps. Cellular Microbiology, 2016, 19(3).
  • Shaw D, Miravet-Verde S, Pinero C, et al. LoxTnSeq: Random Transposon insertions combined with cre/lox recombination and counterselection to generate large random genome reductions. Cold Spring Harbor Laboratory, 2020.
  • Blötz C, Singh N, Dumke R, et al. Characterization of an immunoglobulin binding protein (IbpM) from Mycoplasma pneumoniae. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 685.
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