细菌敲除株构建
基因敲除是验证细菌基因功能最直接的手段。锐志魔方依托 CRISPR-Cas9 与 λRed 同源重组双平台，为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及厌氧菌提供从 sgRNA/同源臂设计、载体构建、转化筛选到基因型鉴定的全流程敲除株构建服务。
一、细菌基因敲除常用策略
根据目标菌株的遗传背景与转化效率，可灵活选择以下策略：
- CRISPR-Cas9 基因编辑：利用 Cas9 在靶位点引入双链断裂，借助同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）实现基因缺失或定点突变；
- 同源重组（allelic exchange）：构建含目标基因上、下游同源臂的自杀型载体，通过单交换/双交换替换或删除目标基因，适用于假单胞菌、沙门氏菌、链球菌等；
- 转座子插入失活：在难以建立同源重组体系的菌株中，利用 Himar1/Tn5 等转座子造成插入失活，快速获得功能缺失株；
- 化学诱变 / 突变积累：适用于表型筛选，但靶点不明确，通常作为辅助手段。
锐志魔方主要采用同源重组与 CRISPR-Cas9路线，确保敲除位点精确、可重复、便于下游回补验证。
二、典型构建流程
三、可承接菌株范围
| 革兰氏阴性/兼性菌 | 革兰氏阳性菌 |
|---|---|
| 假单胞菌 | 链球菌 |
| 肺炎克雷伯菌 | 乳酸菌 |
| 肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 |
| 幽门螺杆菌 | 芽孢杆菌 |
| 鲍曼不动杆菌 | 谷氨酸棒杆菌 |
| 脆弱拟杆菌 | 具核梭杆菌 |
| 牙龈卟啉单胞菌 | 其他革兰氏阳性菌 |
| 大部分革兰氏阴性菌 | 具体可咨询定制 |
四、交付标准
- 至少 2 个独立克隆的基因型 PCR 验证；
- Sanger 测序确认目标位点序列；
- 提供甘油菌、质粒图谱及实验报告。
五、参考文献
- Nao Otsuka, Hyun-Ja, et al. Prevalence and Genetic Characterization of Pertactin-Deficient Bordetella pertussis in Japan. PLoS ONE, 2012, 7(2): e31985.
- Teixeira F L, Pauer H, Costa S B, et al. Deletion of BmoR affects the expression of genes related to thiol/disulfide balance in Bacteroides fragilis. Scientific Reports, 2018, 8(1).
- Jinnethe R, Diana P, Tran T T, et al. A liaR Deletion Restores Susceptibility to Daptomycin and Antimicrobial Peptides in Multidrug-Resistant Enterococcus faecalis. Journal of Infectious Diseases, 2015(8): 1317.
- 李晔, 张西轩, 郭梦征, 等. 利用 λRed 重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌 sopB 基因. 生物技术通报, 2014(9): 7.
参考文献
- [1] Nao, Otsuka, Hyun-Ja, et al. Prevalence and Genetic Characterization of Pertactin-Deficient Bordetella pertussis in Japan[J]. PLoS ONE, 2012, 7(2):e31985.
- [2] Teixeira F L, Pauer H, Costa S B, et al. Deletion of BmoR affects the expression of genes related to thiol/disulfide balance in Bacteroides fragilis[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1).
- [3] Jinnethe R, Diana P, Tran T T, et al. A liaR Deletion Restores Susceptibility to Daptomycin and Antimicrobial Peptides in Multidrug-Resistant Enterococcus faecalis[J]. Journal of Infectious Diseases, 2015(8):1317.
- [4] 李晔, 张西轩, 郭梦征,等. 利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因[J]. 生物技术通报, 2014(9):7.